Biologika – eine neue Generation von Medikamenten, die neue Lösungen erfordern

Zwei Teams des Instituts für Pharmatechnologie FHNW arbeiten mit der Industrie zusammen, um Lösungen für neue Herausforderungen im gesamten Biomanufacturing-Prozess zu finden, von der Zelllinienentwicklung über die Kultur, Aufreinigung, Formulierung, Abfüllung, Fertigung bis hin zur Qualitätssicherung von technischem und präklinischem Studienmaterial.

Biologika haben sich als neue Generation von Medikamenten etabliert, die eine gezieltere Behandlung von Krebs, Autoimmunerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und genetischen Störungen bieten. Heute haben biologische Modalitäten wie Antikörper-Wirkstoff-Konjugate, bispezifische Proteine, und Zell- und Gentherapien noch mehr Möglichkeiten eröffnet, doch stellen sie einzigartige Herausforderungen an die biopharmazeutische Produktion. Inzwischen gibt es einige etablierte Biologika, deren Anwendung aus dem klinischen Bereich in den häuslichen Bereich verlagert wurde, wo die Patientinnen und Patienten sie sich selbst verabreichen können. Dies zieht neue Überlegungen zu ihrer Lagerung, Injektion und alternativen Lieferwegen nach sich.

Zellkultur

Wirtszelllinien von Säugetieren wie die Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder menschliche embryonale Nierenzellen (HEK) fungieren als lebende Fabriken zur Herstellung von Biologika. Um hohe Ausbeuten zu erzielen, ist es wichtig zu verstehen, was in den verschiedenen Phasen der Zellkultur im Bioreaktor geschieht.

Die Raman-Spektroskopie, einschliesslich Analysatoren, Sonden und Software, ermöglicht eine Echtzeit-Analyse von Nährstoffen, Metaboliten, Produktqualität und Lebensfähigkeit der Zellen. Dies hilft den Herstellern, das Verfahren zu kontrollieren und zu entscheiden, wann die Kultur gefüttert werden soll. Die breit angelegte Umsetzung ist jedoch derzeit durch die Entwicklung von Kalibriermodellen begrenzt, die arbeits- und zeitintensive Versuchsaufbauten sowie eine komplexe IT-Infrastruktur erfordert.

In einem Innosuisse-Projekt namens Raman Ready entwickeln Forschende des Instituts für Pharmatechnologie FHNW gebrauchsfertige Kalibriermodelle für die Raman-Spektroskopie in Bioprozessen.

«Durch die Kombination der Raman-Technologie mit Machine-Learning-Expertise wollen wir vielseitige und präzise Modelle erstellen, die für eine Vielzahl von Biologika und Verfahren geeignet sind», sagt Thomas Villiger, Arbeitsgruppenleiter Bioprozesstechnik.

Der Projektpartner für die Implementierung, Endress + Hauser, ist ein führender Anbieter von Raman-Systemen und legt grossen Wert darauf, seinen Kunden hochwertige Sensoren zu liefern.

«Wir sind überzeugt, dass die Zusammenarbeit mit der FHNW dazu beitragen wird, Raman-Systeme für unsere Kunden zugänglicher zu machen und den Einsatzbereich dieser leistungsstarken Technologie zu erweitern», sagt Lukas Jegge, Senior Sales Engineer bei Endress + Hauser.

Aufreinigung von Antikörpern

Nach der Herstellung müssen biologische Modalitäten wie Antikörper, die aus einer Wirtszelle hergestellt werden, vom Kulturmedium in dem sie gezüchtet wurden getrennt werden. Die gebräuchlichsten Verfahren zur Gewinnung und Aufreinigung der Zielbiologika sind Zentrifugation, Membranfiltration und Proteinaffinitätschromatographie. Allerdings können nach der Chromatographie kleine Mengen an Proteinverunreinigungen, so genannte Wirtszellproteine (HCPs), zurückbleiben, welche die Qualität, Sicherheit und/oder Wirksamkeit des Produkts beeinträchtigen können.

In einer gross angelegten Studie, die mit Novartis durchgeführt wurde, analysierte Sherin Panikulam vom Team um Villiger 23 Biologika nach der Affinitätschromatographie. Dabei sollte untersucht werden, welche Arten von HCPs zurückgeblieben sind und weshalb sie zusammen mit den Biologika gewonnen wurden, um die Prozessentwicklung besser steuern zu können.

Von den 449 identifizierten HCPs wurden die meisten zusammen mit weniger als 3 Biologika gewonnen. Einige HCPs wurden jedoch in vielen Biologika identifiziert. Mithilfe von Protein-Netzwerkanalysen konnte Panikulam zeigen, dass die Protein/Protein-Interaktion ein zusätzlicher Mechanismus für die Koelution von HCPs ist, was dazu führt, dass sie chromatographisch nicht entfernt werden können.

«Unsere Erkenntnisse können bei der Entwicklung von Wirtszelllinien helfen, beispielsweise beim Knockdown oder Knockout des primären Bindungspartners in der CHO-Zelllinie. Wir hoffen auch, dass neue Aufreinigungsstrategien entwickelt werden können, um zu verhindern, dass bestimmte Wirtszellproteine ihre Freunde zur Party mitbringen und zusammen mit den Zielbiologika gewonnen werden», so Panikulam.

«Heute brauchen wir ein besseres Wissen über Restverunreinigungen, die in Biologika verbleiben. Diese Ergebnisse sind entscheidend für das Verständnis, wie sich HCPs während des Aufreinigungsverfahrens eines Medikaments verhalten. Und sie unterstützen die Prozessentwicklung, falls ein problematisches HCP entdeckt wird», sagt Nicolas Lebesgue, Principal Scientist in Analytical Characterization bei Novartis.

Aufreinigung von Gentherapeutika

Bei der Gentherapie wird eine Reparatur-DNA-Sequenz in einen viralen Vektor, auch Kapsid genannt, verpackt, der die DNA in den Zellkern schleust. Die Herstellung von Gentherapeutika ist komplex und zeitaufwendig, da der traditionelle Herstellungsprozess drei Plasmide, das Wachstum von Wirts-HEK-Zellen, das Einbringen der drei Plasmide in die HEK-Zellen, die Herstellung viraler Kapside durch die HEK-Zellen, welche die therapeutische DNA-Sequenz enthalten, und die Abtrennung der Kapside von dem für ihre Herstellung verwendeten Material erfordert.

Nicht alle erzeugten viralen Vektoren enthalten die therapeutische DNA. Nach der Herstellung in HEK-Zellen sind etwa 50–80 Prozent der Kapside leer. Zur Gewinnung von 80–90 Prozent vollen Kapsiden und zur Sicherstellung der therapeutischen Wirksamkeit werden Capture- und Polishing-Chromatographie-Schritte eingesetzt. Aufreinigungsverfahren sind für virale Vektoren nicht so gut etabliert oder standardisiert wie für Antikörper, insbesondere in grösserem Massstab. Dies ist ein entscheidender Engpass, wenn es darum geht, Gentherapien erschwinglicher und zugänglicher zu machen.

Im Rahmen eines Projekts mit YMC, einem führenden Entwickler von chromatographischen stationären Phasen und Aufreinigungsgeräten, arbeitet Julia Müller vom Labor Villiger an kontinuierlichen Aufreinigungsstrategien für Adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs).

Anstatt AAVs auf einer einzigen Säule zu erfassen und einige während der Beladung zu verlieren, arbeiten wir mit Doppelsäulen, um den Durchfluss von der ersten auf die zweite Säule zu übertragen, sodass AAVs eine zweite Chance haben, erfasst zu werden», sagt Müller. Danach wird die erste Säule geleert und wieder in das Verfahren integriert, um den Stab zu übernehmen, wenn die zweite Säule voll ist, und so weiter, bis die Aufreinigung abgeschlossen ist. Mit der kontinuierlichen Aufreinigung lassen sich nicht nur mehr AAVs gewinnen – sie verbraucht auch weniger Material und Energie als die Chargenaufreinigung und ist für die Qualitätssicherung einfacher zu charakterisieren.

In ähnlicher Weise wird beim Polishing zur Trennung von vollen und leeren AAVs der reinste Anteil an vollen AAVs aus der ersten Säule extrahiert, während teilreine Anteile, die sowohl leere als auch volle AAVs enthalten, in einer zweiten Säule recycelt werden, was zu einer höheren Ausbeute an vollen AAVs führt, ohne die Reinheit zu beeinträchtigen.

«Die Ergebnisse der FHNW zeigen, dass die kontinuierliche Chromatographie ein vielversprechender Ansatz für die Herstellung von Gentherapien ist, da höhere Ausbeuten erzielt werden und gleichzeitig die Nachhaltigkeit gesteigert und die Kosten gesenkt werden», sagt Thomas Müller-Späth, CEO von YMC.

Produktformulierung von Biologika

Biologika können durch Transport- und Lagerungsbedingungen und bei der Handhabung destabilisiert werden, was zu einem Wirksamkeitsverlust oder unerwünschten Immunreaktionen führen kann. Da ein Teil der Verabreichung von Biologika von der Arztpraxis nach Hause verlagert wird, werden die Patientinnen und Patienten Teil der Kühlkette und tragen eine Mitverantwortung für die konsequente Kühlung und den ordnungsgemässen Umgang mit ihren Biologika.

Um Strukturschäden zu verhindern, werden Biologika mit Tensiden formuliert. Dabei handelt es sich um amphiphile Moleküle, die aus einem hydrophilen Kopf und einem hydrophoben Schwanz bestehen. Tenside verhindern die Aggregation von Biologika, indem sie ihre Adsorption an Luft-Wasser-Grenzflächen blockieren, die im Rahmen der Herstellung, der Lagerung, des Transports und der Anwendung auftreten. Derzeit werden in der kommerziellen Formulierung von Biologika nur drei Tenside verwendet, deren Abbau mit Problemen verbunden ist.

In einem Projekt, das in Zusammenarbeit mit Novartis durchgeführt wurde, haben Prof. Dr. Oliver Gemershaus und sein Team 40 neue potenzielle Tenside bewertet, darunter bereits existierende Moleküle sowie neuartige Tenside, die von Novartis synthetisiert werden. Sie untersuchten zunächst die biophysikalischen Eigenschaften der Kandidaten und danach ihre Fähigkeit, eine durch Agitation induzierte Aggregation zu verhindern, wenn sie mit verschiedenen Arten von Biologika formuliert wurden, darunter ein ungeordnetes Protein, ein Fragment einer Antigen-Bindungsregion, monoklonale Antikörper und ein Fusionsprotein. Vor allem wurde die chemische und enzymatische Abbauneigung der neuen Tenside beurteilt.

Das Team identifizierte zwei Finalisten, die im Vergleich zu bestehenden Formulierungen eine vergleichbare oder bessere Stabilisierung von Biologika und einen deutlich geringeren Tensidabbau aufwiesen.

«Bei der Auswahl der oben genannten alternativen Tenside war es entscheidend, über die Expertise der FHNW zu verfügen», sagt Karoline Bechtold-Peters, Director Science & Technology bei Novartis. «Wir werden weiterhin gemeinsam neue Tenside erforschen.»

Die Kompetenzen des Instituts für Pharmatechnologie und Biotechnologie kamen bei zwei weiteren Projekten mit Novartis zum Tragen: Micro-Downscale-Modelle zur Bewertung der Frost-Tau-Stabilität von biologischen Wirkstoffen sowie physikalische Beurteilung und Modelle zur Bewertung der Silikonöl-Abbauaktivität von biologischen Wirkstoffen, die für Produkte in Fertigspritzen unerlässlich sind.

«Frühe Downscale-Modelle und -Simulationen ermöglichen eine schnelle erste Anwendung beim Menschen und helfen, den Entwicklungszeitplan zu beschleunigen», sagt Bechtold-Peters.

Charakterisierung von Partikeln

Nachdem Biologika hergestellt, aufgereinigt und formuliert wurden, werden sie einer Qualitätssicherung unterzogen, um sicherzustellen, dass sie die geltenden Standards für injizierbare Arzneimittelformulierungen erfüllen, einschliesslich der Grenzwerte für sichtbare und nicht sichtbare Partikel.

Die Partikel messen in der Regel zwischen einigen Nanometern und Hunderten von Mikrometern. Sie können unabhängig vom normalen Herstellungsprozess auftreten, beispielsweise Cellulosefasern aus Reinigungsverfahren. Sie können aber auch intrinsisch sein, ausgehend vom normalen Herstellungsprozess oder dem Behälterverschlusssystem; oder sie können inhärent sein, ausgehend von den für die Formulierung verwendeten Hilfsstoffen oder dem Wirkstoff selbst, beispielsweise erwartete Aggregate oder Trübungen.

Die Kalibrierung von Instrumenten, die für die Dimensionierung und Zählung solcher Partikel verwendet werden, erfolgt mit perfekt sphärischen Referenzpartikeln, die einen hohen optischen Kontrast bieten. Jedoch stellen intrinsische Proteinpartikel aufgrund ihrer unregelmässigen Form und ihrer Lichtdurchlässigkeit eine Herausforderung für solche Instrumente dar.

Um dieses Problem zu lösen, hat die Gruppe von Germershaus in einem Kooperationsprojekt mit Roche unregelmässig geformte Partikel hergestellt, die für unsichtbare und sichtbare Partikel repräsentativ sind. Created by two photo polymerisation (2PP) printing, these artificial particles may serve as new reference material mimicking the morphological, optical and physical properties of protein particles. 

In ihrer Studie verglichen sie das neue Referenzmaterial mit derzeit verwendeten Polystyrolkugeln sowie mit Standardpartikeln des National Institute of Standards and Technology und mit echten Proteinpartikeln, die durch Exposition von monoklonalen Antikörpern gegenüber unterschiedlichen Belastungen gewonnen wurden.

«Wir arbeiten derzeit an einer umfassenden Evaluierung der Eignung der von uns gemeinsam mit Interessenvertretern aus der pharmazeutischen Industrie entwickelten Standards für proteinähnliche Partikel, mit dem Ziel, die Charakterisierung von unsichtbaren und sichtbaren Proteinpartikeln in Laboren und Organisationen zu harmonisieren», so Germershaus.

Verpackung und Verabreichung

Nachdem Biologika formuliert und charakterisiert wurden, werden sie einem Abfüllprozess unterzogen, bei dem der biologische Wirkstoff in eine sterile Durchstechflasche oder Spritze überführt, verschlossen, geprüft und etikettiert wird. Manche Biologika werden vor dem Verschliessen lyophilisiert, um ihre Stabilität zu erhöhen. Im Process Technology Center der Hochschule für Life Sciences FHNW steht ein Reinraum zur Verfügung, in dem Unternehmen neue Abfüllprotokolle entwickeln, Referenzproben abfüllen oder Biologika für präklinische Studien herstellen können.

Immer häufiger werden Biologika für die Verabreichung zu Hause mit Fertigspritzen, Autoinjektoren oder Patch-Pumpen angeboten. Diese Medizinprodukte bieten den Patientinnen und Patienten Komfort und Autonomie und sollen dazu beitragen, Nadelphobien und Verabreichungsfehler zu vermeiden.

Fertigspritzen enthalten die richtige Dosierung und die Patientin bzw. der Patient kann die Injektionsgeschwindigkeit selbst steuern. Autoinjektoren sind halbautomatisch und verfügen über einen Knopf zum Starten der Injektion, eine versteckte Nadel, die durch eine Sicherheitsabdeckung geschützt ist, und zeigen durch hörbare Klicks an, wenn die Injektion abgeschlossen ist. Patch-Pumpen und andere tragbare Medizinprodukte sind die neuesten und fortschrittlichsten Optionen für die Selbstverabreichung von Biologika. Die neuesten Produkte verfügen über innovative Vorrichtungen zur Rekonstitution von lyophilisierten Biologika und ermöglichen die Verabreichung grösserer Volumina als subkutane Infusion.

Das Team von Germershaus arbeitet mit Unternehmen aus der Pharma-, Verpackungs- und Medizinproduktebranche zusammen und konzentriert sich dabei auf die Entwicklung neuer Injektionsgeräte. Die subkutane Verabreichung grösserer Volumina ist derzeit ein wichtiges Thema. Die Studien reichen von der Prüfung der Kompatibilität von Produkten (z. B. Patch-Pumpen) mit Biologika bis zur Abfüllung in neuartigen Darreichungsformen (z. B. Kartuschen) unter aseptischen Bedingungen. Die Abfüllung kann manuell oder automatisiert in Chargengrössen von einstelligen Stückzahlen bis zu 1 000 Stück pro Stunde erfolgen.

Eckdaten
Partner:	Endress + Hauser, Novartis, Roche, YMC ChromaCon, Sensile Medical AG
Finanzierung:	Raman Ready: Innosuisse 114.286 IP-LS Development of a Mobile Dosing Pump for the Administration of Biologics: 25721.1 PFLS-LS