Automatisierte Vorbereitung von Vollblutproben, Hochschule für Life Sciences FHNW

Das PAL RTC (siehe Abbildung unten) kann zusätzliche Probenvorbereitungsschritte durchführen, beispielsweise die Zugabe von Standards und Reagenzien, Zentrifugation und Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE). Das LCMS-P 80 Tool ist mit einer speziellen Nadel ausgestattet, die eine direkte Probenentnahme aus Primärröhrchen ermöglicht. Mithilfe spezieller Adapter können Primärröhrchen zu und von Modulen des Systems transportiert werden, beispielsweise zum Vortexen.

Verschiedene Adapter ermöglichen die Verwendung unterschiedlicher Primärröhrchenformate. Der optische Sensor, der sich an der Probenschleife des Tools befindet (orangefarbene Dreiecke in der Skizze oben), überwacht die Ansaugung der Probe, von Luftspalten oder Blasen. Verschiedene Probenahmesituationen (Injektion mit Luftspalten, Verstopfungen, Blasen) erzeugen unterschiedliche Sensorsignalmuster, die definierte Systemaktionen auslösen.

PAL RTC-Autosampler mit einer 1-ml-Spritze, LCMS-P80-Injektionswerkzeug, Vortex-Mischer, Zentrifuge. Agilent LC 1200 und Agilent MS 6460 Triple Q-MS. Das getestete Laborblut wurde durch Blutspenden in Primärröhrchen (Vacuette™, Vacutainer™ usw.) bereitgestellt. Alle Chemikalien wurden von Sigma-Aldrich bezogen. Die Hämatokritwerte wurden durch Mischen definierter Verhältnisse von Plasma und Erythrozyten hergestellt.

Es wurde eine Reihe von Tests durchgeführt, um zu beurteilen, ob das LCMS-P80-Injektionswerkzeug auf dem PAL RTC eine korrekte Übertragung von Flüssigkeit (Blut/Reagenz) von einem Fehlerzustand unterscheiden kann. Die möglichen Fehlerzustände sind unten aufgeführt:

• Volle Ampulle, saubere Nadel.
• Leere Ampulle, saubere Nadel, keine Probe.
• Verstopfte Nadel (Verstopfung).
• Volle Ampulle, schäumende Probe.

Es können Fehlerbehandlungsroutinen definiert werden. In dieser Versuchsreihe war die Routine wie folgt:

Error > clean tool > re-try same vial. If error persists > clean tool > next sample. If error persists > abort

Vollblut besteht aus Wasser, Salz, Proteinen, Lipiden und intakten Erythrozyten. Diese neigen dazu, an Oberflächen oder bei Kontakt mit organischen Lösungsmitteln zu koagulieren. Wirksame die Ausfällungen im System sowie die Ablagerung von Biofilmen verhindern, sind daher von entscheidender Bedeutung. Die folgenden Rasterelektronenmikroskop-Aufnahmen zeigen den mittleren Abschnitt von drei Probenschleifen von LCMS-P80-Werkzeuge nach 500 Injektionen von Vollblutproben. Die Werkzeuge wurdenzwischen jeder Probe mit drei verschiedenen Verfahren gereinigt.

Einfaches Verfahren:

• 1 x 100 μl Wasser mit 0,1 % Ameisensäure.
• Sichtbare Ablagerung von Materialien.

Standardverfahren:

• 2 x 100 μl Wasser mit 0,1 % Ameisensäure / 2 x 100 μl Methanol mit 0,1 % Ameisensäure/ 2 x 100 μL Wasser mit 0,1 % Ameisensäure.
• Keine sichtbare Ablagerung von Materialien.

Erweitertes Verfahren:

• 100 μl Decon™ Contrad™ 70, gefolgt vom Standardverfahren.
• Leichte Ablagerung von Materialien.

Das LCMS-P 80-Tool wurde verwendet, um Proben mehrerer typischer Arzneimittel für das TDM sowie für in der Diagnostik relevante Verbindungen vorzubereiten. Es wurden dotierte und leere (rot markierte) Vollblutproben analysiert.

Carbamazepin

Carbamazepin ist ein Vertreter der Antiepileptika. Für die Festlegung der richtigen Dosierung ist die Blutüberwachung von entscheidender Bedeutung.

• Methode: Elutionsmittel A: Wasser 0,1 % Ameisensäure / Elutionsmittel B: Methanol 0,1 % Ameisensäure // Durchfluss: 0,45 ml/min // Laufzeit: 6 min
• Säule: Waters Coretecs C18 2,1 x 100 mm 2,7 μm
• MS-Parameter: Modus: positiv MRM: 237>194
• Blutvolumen: 10 μl / Injektionsvolumen: 2 μl

Diclophenac

Diclophenac ist ein nichtsteroidales Antirheumatikum und aufgrund seiner molekularen Eigenschaften ein repräsentativer Wirkstoff für das Arzneimittelmonitoring.

• Methode: Elutionsmittel A: Wasser 2 mM NaF / Elutionsmittel B: Acetonitril 2 mM NaF // Durchfluss: 0,5 ml/min // Laufzeit: 7 min
• Säule: Zorbax SB-C8 4,6 x 50 mm 1,8 μm
• MS-Parameter: Modus: positiv MRM: 296>249
• Blutvolumen: 10 μl / Injektionsvolumen: 2 μl

25-Hydroxy-Vitamin D3

• 25-Hydroxy-Vitamin D3 ist ein wichtiger Marker für die Speicherung von Vitamin D.
• Methode: Elutionsmittel A: Wasser 0,1 % Ameisensäure / Elutionsmittel B: Methanol 0,1 % Ameisensäure // Durchfluss: 0,45 ml/min // Laufzeit: 6 min
• Säule: Waters Coretecs C18 2,1 x 100 mm 2,7 μm
• MS-Parameter: Modus: positiv MRM: 401>383
• Blutvolumen: 10 μl / Injektionsvolumen: 20 μl

Das neue LCMS-P 80-Gerät kann Vollblut mit normalen Hämatokritwerten (30–50 %) direkt aus Primärröhrchen mit guter Genauigkeit und Präzision pipettieren. Dabei wird ein durchschnittlicher Korrekturfaktor angewendet. Bei hohen Hämatokritwerten sollte ein anderer Korrekturfaktor verewendet werden.

Es wurden Waschverfahren entwickelt, um die Verschleppung von Analyten zu minimieren. Ein Verfahren zur Minimierung der Ablagerung von Blut auf den Systemoberflächen hat sich als erfolgreich erwiesen.

Das System, das aus einem PAL RTC-Autosampler besteht und, an ein Agilent LC-MS-System angeschlossen ist, kann die Probenvorbereitung und LC-MS-Analyse für Vollblutproben aus Primärröhrchen durchführen. Die Leistung des Systems wurde mit mehreren typischen Verbindungen in therapeutisch relevanten Konzentrationen getestet.

Der Sensor des LCMS-P80-Tools erkennt Fehlerzustände zuverlässig und erhöht die Prozesssicherheit erheblich.

[1] Linder et al. Bioanalysis (2015) 1(16) 2013-2039

[2] Kearney et al. BMJ. (2006) 332(7553):1302-8

[3] Shah et al. Nutrition Journal (2011) 10:4