Eine sicherere und effizientere Screening-Methode für Foracylcarnitine, Aminosäuren und Steroide bei Neugeborenen mittels LC-MS
In der Schweiz werden jährlich rund 84 000 Neugeborene mittels Trockenblut-Spot-Analyse auf angeborene Stoffwechselstörungen untersucht [1-3]. Die traditionellen Methoden in diesem Bereich sind jedoch aufwendig, da sie auf Stanzen und Offline-Extraktion basieren. Kritisch ist zudem, dass es aufgrund elektrostatischer Effekte manchmal zu Verwechslungen der Proben kommt, wodurch die gestanzten Proben in die falsche Röhre oder Vertiefung gelangen. Hier wird eine Methode vorgestellt, die Steroide, Acylacarnitine und Aminosäuren auf Basis des DBS-500 verwendet.
Arbeitsablauf
Klassisches DBS-Stanzen im Vergleich zu Online-CAMAG DBS-500. Der klassische Arbeitsablauf umfasst einen halbautomatischen Stanzschritt, während das automatisierte DBS-500 die direkte Extraktion von Blutflecken in das Massenspektrometer ermöglicht.
Materialien und Methoden
Es wurden ein vollautomatischer Trockenblutfleck-Probenehmer, der DBS-MS 500 (CAMAG, Muttenz BL, CH), und ein 6410 Triple-Quadrupol-Massenspektrometer (+ESI) mit einer quaternären HPLC-Pumpe der Serie 1100 (Agilent, Santa Clara CA, USA) verwendet. Die Lösungsmittel und Additive wurden von Sigma-Aldrich (Buchs SG, Schweiz) bereitgestellt. Standards für Aminosäuren und Acylcarnitine wurden von Chromsystems (München, Deutschland) bereitgestellt. Die Methode wurde gemäß den ICH-Richtlinien validiert [4].
Ergebnisse und Diskussion
Extraktionsbedingungen
Eine optimale Extraktion wird durch eine Mischung aus Methanol und Wasser im Verhältnis 7:3 erreicht. Diese stellt den besten Kompromiss zwischen der Extraktion der Analyten, der Extraktion geringer Mengen an Suppressiva und einer minimalen Beeinträchtigung der chromatographischen Trennung dar.
Chromatographie
Die meisten Verbindungen werden nur durch MRM getrennt. Deoxycorticosteron und 17- OHP, die das gleiche MRM haben, werdendagegen durch Chromatographie getrennt.
Validierung
Bei Verwendung der automatisierten Methode betrug der gemittelte CV-Wert der Aminosäuren und Acylcarnitine 4,2 % innerhalb eines Tages und 7,2 % über mehrere Tage. Dies war vergleichbar mit den Ergebnissen der etablierten Routinemethode, bei der ein CV-Wert von 5,6 % für einen Tag und 6,3 % für mehrere Tage ermittelt wurde.
Schlussfolgerungen
Es hat sich gezeigt, dass die neue Direktelutionsmethode gegenüber der herkömmlichen Methode erhebliche Vorteile bietet. Die Kombination der 25 Marker ermöglicht ein vollautomatisches Screening auf mehrere Krankheiten in weniger als 2,5 Minuten pro Probe.
Ausblick
Dieser neue Ansatz der direkten Extraktion verbessert nicht nur Neugeborenen-Screening-Programme erheblich, sondern eröffnet auch neue Möglichkeiten für die Analyse von getrockneten Blutstropfen in anderen Bereichen, wie z. B. Doping-Screening, therapeutischer Arzneimittelüberwachung oder Point-of-Care-Analytik.
Referenzen
[1] Dried Blood Spots: Applications and Techniques ISBN: 9781118054697
[2] Neugeborenenscreening Kinderspital Zürich http://www.neoscreening.ch
[3] Fingerhut et al. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28, 965–973
[4] ICH-Validierungsrichtlinien http://www.ich.org
Projektdetails
- Typ
- Forschungsprojekt
- Forschungsfeld
- Instrumentelle Analytik
- Hochschule/Institut
- Hochschule für Life Sciences FHNW / Institut für Chemie und Bioanalytik
- Partner
CAMAG Chemie-Erzeugnisse & Adsorptionstechnik AG; University Children's Hospital, Children’s Research Center, Swiss Newborn Screening Laboratory- Mitarbeit
- Christian Berchtold, Irene Wegner, Stefan Gaugler, Tamara von Däniken, Markus Wyss, Ralph Fingerhut, Götz Schlotterbeck
Kontakt
Prof. Dr. Stefan Gaugler
- Telefon
- +41 61 228 50 98
- stefan.gaugler@fhnw.ch